Окончив сельскую школу первым учеником, по ходатайству сельского учителя, Дмитрия определили в Бирюченское духовное училище, где он содержался на средства своего учителя-благодетеля. После окончания духовного училища по I разряду в 1884 году, он поступил в Воронежскую духовную семинарию.
В 1890 году окончил Воронежскую духовную семинарию по I разряду, вступил в брак и 4 ноября был рукоположен во диакона к Казанской пригородной церкви города Коротояка епископом Анастасием (Добрадиным).
15 декабря 1892 года был перемещен в Преображенскую церковь слободы Матрено-Гезевой Бирюченского уезда, а 23 февраля 1893 года — в Троицкую церковь в селе Алексеевке того же уезда.
После кончины супруги в 1893 году поступил в Киевскую духовную академию.
11 августа 1896 года пострижен в монашество с наречением имени в честь святителя Митрофана Воронежского.
15 июня 1897 году рукоположен во иеромонаха епископом Каневским Сильвестром (Малеванским).
В том же году окончил академию со степенью кандидата богословия и назначен инспектором Иркутской духовной семинарии.
В 1902 году назначен ректором Могилевской духовной семинарии в сане архимандрита.
11 февраля 1907 года хиротонисан во епископа Гомельского, викария Могилевской епархии. Хиротония состоялась в Свято-Троицком соборе Александро-Невской Лавры. Чин хиротонии совершали: митр. СПБ Антоний (Вадковский), митр. Московский Владимир (Богоявленский), митр. Киевский Флавиан (Городецкий) и др. иерархи.
Как активный борец с сектантством и поборник русских интересов, владыка Митрофан был избран депутатом в III Государственную Думу, в которой присоединился к фракции правых.
С 9 ноября 1912 года - епископ Минский и Туровский.
Большая часть времени, проведённая преосвященным Митрофаном на Минской кафедре пришлась на тяжёлое военное время. Начавшаяся в 1914 г. Первая мировая война не обошла стороной пределов его епархии. В этих тяжёлых условиях епископ Митрофан развернул широкую благотворительную деятельность по оказанию помощи мирным жителям, оставшимся без крова из мест, захваченных врагом, а также по организации епархиальных лазаретов для раненых воинов. Архипастырь часто ездил на фронт для поддержания морального духа русского воинства и не раз попадал под вражеский обстрел, проявляя в таких ситуациях чудеса выдержки и спокойствия. За особую деятельность по обстоятельствам военного времени епископ Митрофан 14 мая 1916 г. был награждён орденом Св. Александра Невского.
С 6 июля 1916 года - епископ Астраханский, где ему также удалось завоевать всеобщее уважение и любовь. Духовный авторитет епископа Митрофана оказался столь велик, что его противникам, пришедшим к власти после Февральской революции, так и не удалось сместить "черносотенного" владыку с занимаемой им кафедры.
Был членом Собора и председателем одной из комиссий Собора 1917/1918 гг. Сторонник патриаршества.
В знак протеста, против большевистского декрета "Об отделении Церкви от государства" владыка Митрофан организовал в феврале 1918 года крестный ход, который стал настоящим событием в истории города. По оценкам современников, в нём приняли участие чуть ли не половина населения Астрахани. По словам очевидца, "это было торжество веры, торжество Православия, которого так боялись творцы новых идей".
В 1918 году ко дню Св. Пасхи возведен в сан архиепископа.
После взятия города большевиками доброжелатели уговаривали его тайно покинуть Астрахань и избежать грозящей ему расправы. Но архиепископ Митрофан не согласился, твёрдо ответив духовенству своей епархии: "Вы предлагаете мне побег, и это в то самое время, когда у нас на глазах расстреливают невинных наших братьев. Нет, я никуда не уеду от своей паствы, на моей груди Крест Спасителя, и он будет мне укором в моём малодушии... Знайте, я совершенно чист и ничем не виновен перед своей Родиной и народом".
8 июня 1919 года вл. Митрофан был арестован по обвинению в "белогвардейском заговоре". Несмотря на многочисленные ходатайства верующих, участь архиепископа Митрофана была уже заранее предрешена.
В три часа утра 6 июля 1919 года к камере, где содержался архиепископ Митрофан, подошли комендант ЧК Волков и начальник караула. Комендант вошел в камеру и, толкнув ногой спавшего на койке архиепископа, закричал: «Вставай!» Владыка встал, попытался было надеть рясу, но комендант схватил его за воротник и закричал: «Живее выходи, на том свете обойдешься...» И, цепко схватив его за руку, потащил к двери. Оказавшись во дворе, Волков быстро зашагал, влача за собой жертву. Архиепископ был в одном белье, босиком; сделав несколько шагов, он споткнулся и упал. Его подняли и быстро довели до закоулка, где производились расстрелы. Там уже стояли трое красноармейцев с винтовками. Увидев их и поняв, зачем его сюда привели, архиепископ Митрофан благословил их по-архиерейски двумя руками, за что Волков ударил его рукоятью револьвера по правой руке и, сейчас же схватив владыку за бороду, с силой нагнул его голову вниз, и выстрелил из револьвера в висок. Архиепископ упал.
Архиереи были не единственными убитыми тогда в Астрахани в застенках ЧК, несколько десятков казненных должны были быть погружены на телеги и отвезены к общей могиле. Протоиерей Димитрий Стефановский договорился с одним из возчиков за деньги доставить тела казненных архиереев в условленное место, пообещав ему произвести погребение до наступления рассвета. Около часа ночи возчики вывезли из тюрьмы тела убитых. Около Красного моста одна из повозок остановилась, и с нее сняли тела двух покойников и переложили в телегу.
Могила была уже вырыта около Астраханского Покрово-Болдинского монастыря. Рубашка архиепископа Митрофана была окровавлена на груди и у рукавов, висок раздроблен, левая часть бороды вырвана, на сгибе правой руки был синяк и кровоподтек. Архиереев одели в чистое белье, владыку Митрофана в священнические одежды; протоиерей Димитрий снял с себя наперсный крест для архиепископа Митрофана и к его цепочке прикрепил железную коробочку с запиской, где излагались обстоятельства их кончины и погребения.
В декабре 2001 года архиепископ Астраханский Митрофан был причислен к лику новомучеников и исповедников Российских. 14 апреля 2002 года в Астраханском Покровском кафедральном соборе, по благословению архиепископа Астраханского Ионы, состоялось торжественное прославление нового угодника Божия. На иконе написанной по случаю прославления Собора новомучеников и исповедников Российских в 2000 году на десятом клейме владыка Митрофан был изображен с нимбом святого, участвующим в историческом Астраханском крестном ходе, организованном им же в 1918 году. Архиерей изображен в центре группы верующих, смело движущихся навстречу нацеленных на них винтовок большевистских солдат.
В Воронеже жил потомок архиепископа Митрофана, профессор Воронежского Медицинского Института Ткачев Тихон Яковлевич (1885-1970 годы жизни).
В настоящее время в Воронеже проживает правнук архиепископа, Ткачев Игорь Викторович (доцент ВГПУ).